Suche eine Versuchsanweisung zu Western Blot, da ich eine Versuchsplanung erarbeiten soll, dazu suche ich ein paar anregungen wie man das Gel ansetzt, was für einen Längenstandard benutzt usw.
Im speziellen soll es darum gehen Proteine über Gelelektrophorese unspezifisch und danach auch spezifisch nachzuweisen.
Das Protein b-Galactosidas soll flurizierend markiert werden über spezielle antikörper und somit nachgewiesen.
Also was ich suche sind Versuchsvorschriften über die Bestandteilen der Gele etc, und theoretische grundlagen im allgemeinen . Und wenn wer diesen Versuch oder ihn ähnlich mal behandelt hat kann sich ja gerne melden.
Dieser Beitrag wurde bereits 1 mal editiert, zuletzt von »TVK_NoWaY« (01.03.2011, 21:37)
Es ist wichtig zu wissen, in welchem Rahmen du Informationen benötigst. Geht es um einen Vortrag/ Hausarbeit für die Schule oder brauchst du höhere Informationen für die Uni?
Keine lust dir mein Altprotokoll zu schicken damit du einfach alles kopierst. Deshalb ne Zusammenfassung:
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
- Polyacrylamid entsteht durch Copolymerisation von Acrylamid und N'N'-Methylenbisacrylamid
- Vernetzungsgrad (Porengröße) wird durch Konzentration und Verhältnis von Acrylamid und N'N'-Methylenbisacrylamid bestimmt
- Verknüpfung wird durch radikalische Polymerisation mit Ammoniumperoxodisulfat gestartet
- Bildung von Sulfatradikalen durch Tetramethylethylendiamin (TEMED) katalysiert
- Tertiärstruktur der Proteine wird durch Natriumdodecylsulfat (SDS) zerstört
- Dodecylsulfatanionen binden mit hydrophoben Schwänzen an hydrophobe Regionen in nativen Proteinen (meist im Inneren) und zerstören nicht kovalente Bindungen
- es werden ca. 1,4g SDS/g Protein gebunden
- dadurch starke negative Ladung aller Proteine und Laufstrecke auf Gel nur von Proteingröße (relative Molekülmasse) abhängig
Western Blot:
- beginnt mit Transfer der Proteine vom SDS-PAGE auf eine Membran mit Hilfe eines elektrischen Feldes
- zu Proteinen auf Membran wird Lösung mit Antikörpern gegeben welche spezifisch an gesuchtes Protein binden (in deinem Fall b-Galactosidase)
- Antikörper dürfen nicht an andere Proteine binden
- Zugabe von zweitem Antikörper, welcher spezifisch an ersten Antikörper bindet
- an diesen zweiten Antikörper ist ein Enzym gebunden (z. B. Alkalische Phosphatase)
- Enzym wandelt ein Substrat (z. B. BCIP/NBT) in farbiges Präzipitat um
- so nur lokale Farbveränderung wo sich gesuchtes Protein befindet
In deinem Fall wird der sekundäre Antikörper wohl einen fluoreszierenden Farbstoff gebunden haben.
Durchführung ist ziemlich lang, falls ihr auch alle Puffer für die SDS-PAGE selbst herstellen müsst und die Gele selber gießen.
Als Marker könnte man z. B. Broad Range von Bio-Rad benutzen. Der enthält auch b-Galactosidase.
Falls du noch ne ungefähre Durchführung brauchst kann ich später nochmal was schreiben. Bin jetzt erst mal weg.
Dieser Beitrag wurde bereits 3 mal editiert, zuletzt von »GWC_Blackbird« (01.03.2011, 22:27)
Vielen dank erstmal für schnelle antwort und hilfe.
wie du schon geschrieben hast wird sich das ganze wohl eine längere angelegenheit sein, da die puffer etc alle selbst angestzt werden müssen.
Haben wohl noch einen längeren versuch wo wir zum ersten mal proteine mit einer gelelekrophorese auftrennen bevor ich mich diesem versuch beschäftigen muss aber hätte trozdem recht gerne noch deine ungefähre durchführung.
Den wenn der Versuch daneben geht sind mehrere praktikumstage einfach verschwendet gewesen.
Dir ist schon klar, dass der Sinn eines solchen Praktikums nicht ist, im Masters nachzufragen, ja?
Was würdest du denn später machen, wenn du eine neue experimentelle Technik anwenden willst, aber nicht genau weißt, wie es funktioniert?
Original von El_Marinero
Was würdest du denn später machen, wenn du eine neue experimentelle Technik anwenden willst, aber nicht genau weißt, wie es funktioniert?
Original von GEC|Bats
oida i versteh halt nur bahnhof ~
aber masters rox!
Absolut...
@Marinero: Ist doch auch ne Art Netzwerken.. Wissensmanagement: Welches Wissen ist zu welcher Zeit an welchem Ort in welcher Qualität zu finden? Das Masters ist nunmal eine Art Expertenforum für verschiedene Themenbereiche.. Insbesondere Informatik und BWL Geschichten..
@el Wie kommst du darauf, dass ich mit null plan an die sache heran gehe?
Wie oben gesagt soll ich eine Versuchsdurchführung erarbeiten. Aber vorher sollte ich mich im internet dazu informieren und genau das mache ich hier gerade und ich bin auch nicht so naiv und beziehe meine quellen nur aus dem masters dazu.
Und ich werde auch zu dem Thema noch informationen von dem Leiter bekommen und wenn es bedeutet sich vorab dazu zu informieren wobei die mesiten sachen dazu auf englisch sind leider ist es sicher nicht verwerflich auch diese quelle zu nutzen.
Ihr werdet doch sicher noch ein Skript bekommen in dem steht wie ihr die Puffer anzusetzen habt und wie man Gele gießt.
Ne Anleitung zu posten ist ziemlich sinnfrei da ich kA hab wie viel Puffer ihr braucht, was ihr für Gelapparaturen benutzt oder mit welcher Spannung die Gele laufen etc.
Ansonsten sollte es genug Anleitungen bei Google geben. Der erste Treffer sieht schon gut aus.
Zitat
Original von GEC|Bats
